阿伦膦酸钠对大鼠股骨骨质疏松性骨折愈合过程的影响

【摘要】第一部分大鼠骨质疏松性动物模型建立目的：观察切除卵巢对雌性SD大鼠股骨骨密度和生物力学特性的影响，为后续实验提供有效的骨质疏松模型。方法：选用100只4月龄成年雌性Sprague—Dawley(SD)大鼠，体重250-300克，随机分为空白组5只，剩余95只大鼠在无菌条件下切除双侧卵巢进行去势，建立骨质疏松动物模型。术后8周，应用小动物Micro-CT对近端股骨进行扫描与三维重建分析；用双能X线检测去势组大鼠与空白组大鼠骨密度并做统计学分析；采用生物力学实验，比较去势组大鼠和空白组大鼠骨的力学强度。结果：Micro-CT检测结果表明，去势组大鼠骨微结构参数如骨小梁厚度、骨皮质厚度和骨小梁数量明显低于空白组。双能X线检测显示8周以后，去势组大鼠与空白组大鼠骨密度分别为0.219±0.039（g/cm2）和0.249±0.063（g/cm2），骨密度与空白组大鼠有明显差别（P＜0.05）。生物力学研究测试显示与空白对照组相比，去势8周以后其力学强度出现明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：通过对雌性大鼠采取切除卵巢去势的方式，能够在8周后建立鼠的骨质疏松模型。这是一种指导骨质疏松发病机理的探究和新药的研发理想实用的骨质疏松动物模型。第二部分阿伦膦酸钠在大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中的实验研究目的:本研究是以去卵巢Sprague-Dawley(SD)大鼠建立的骨质疏松骨折模型为研究对象，通过检测骨生物力学性能的变化情况和利用组织形态学、免疫组织化学和分子生物学等实验方法，探讨阿伦膦酸钠对大鼠股骨骨质疏松性骨折愈合过程的相关因子在不同时期生物学特征的影响，以阐明其作用机制，为临床应用阿伦膦酸钠防治骨质疏松性骨折提供理论依据和有益线索。方法：造模成功后将模型组内的60只大鼠右侧股骨制作成中段开放性骨折并予克氏针内固定。剩余的30只仅穿克氏针，不造成骨折作为假手术组。骨折模型组随机分成对照组和治疗组，每组30只；阿伦膦酸钠组：骨折固定术后二膦酸盐药物按1.15mg/(kg.week)灌胃，每周一次；假手术和对照组：骨折固定术后给予同样剂量及次数的生理盐水灌胃。分别于术后1，2，4，6，8和12W各组随机选取5只大鼠摘眼球取血，离心取血清，测定ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1的表达变化。行双能X线检查比较各组骨折愈合情况。处死大鼠后，在骨折端取骨痂标本，4%多聚甲醛固定过夜。各组经5%硝酸脱钙组织石蜡切片行HE和抗酒石酸（TRAP）染色、BMP-2、bFGF、IGF-1免疫组化检测，并对第4和12周的股骨标本进行Micro-CT，扫描电镜观察和三点弯曲生物力学检测各组骨折愈合情况。结果：骨痂的双能X线检测和组织学观察发现，与对照组相比经阿伦膦酸钠治疗两周后骨折愈合进程明显加快。第2周组织切片HE染色发现，阿伦膦酸钠组骨痂形成增多，软骨内成骨过程较对照组加快。连续治疗6周后，对照组骨折线清晰可见，阿伦膦酸钠组骨折线模糊，提示更早达到骨性愈合。药物干预治疗后，与对照组相比阿伦膦酸钠组TRAP染色破骨细胞数量明显减少且成逐渐减少趋势。ELISA结果显示，假手术组血清中ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1在所有时间段内无显著性差异。阿伦膦酸钠组血清ALP和对照组相比在第2、4和6周的差异有统计学意义。治疗两周后，阿伦膦酸钠组和对照组中BMP-2、bFGF、IGF-1的表达均达到高峰，8~12周时回落到正常水平。治疗前8周，对照组血清中BMP-2少于阿伦膦酸钠组，两组在第2和6周的差异有统计学意义。治疗后第4和8周，对照组中bFGF少于阿伦膦酸钠组，差异有统计学意义。与对照组相比，治疗后第2和4周阿伦膦酸钠组血清中IGF-1升高明显，两组见差异有统计学意义。免疫组化结果显示阿伦膦酸钠组和对照组在骨折愈合中BMP-2、bFGF、IGF-1的表达细胞定位无差别。治疗4周后BMP-2免疫组化平均光密度值阿伦膦酸钠组高于对照组，8周时低于对照组且差异有统计学意义。治疗4，8周后bFGF免疫组化平均光密度值阿伦膦酸钠组高于对照组，差异有统计学意义。治疗2和4周后IGF-1免疫组化平均光密度值阿伦膦酸钠组高于对照组差异有统计学意义。MicroCT成像显示对照组的骨痂体积和矿化比例在治疗后4周明显少于阿伦膦酸钠组，而治疗12周后没有明显改变。SEM结果显示，治疗12周后阿伦膦酸钠组骨痂组织吸收陷窝数明显低于对照组。生物力学试验检测两个时间点阿伦膦酸钠组标本最大载荷均高于对照组差异有统计学意义。结论：阿伦膦酸钠具有上调大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1等促进成骨的细胞因子含量，抑制破骨细胞的活性，增加新生骨痂和成骨细胞活性，提高骨痂骨密度和骨质生物力学强度进而来促进骨质疏松性骨折的愈合的作用。
【作者】张钢；
【导师】蒋电明；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】骨质疏松症；骨折愈合；阿仑膦酸钠；卵巢切除；生物力学；

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